Tecniche di puntura del midollo osseo e biopsia nei primati non-umani: focus sull'applicazione dell'ago per biopsia

I primati non- umani (NHP) sono animali sperimentali fondamentali per la ricerca ematologica preclinica, lo sviluppo di farmaci con cellule staminali, l'esplorazione dei meccanismi immunitari e gli studi di medicina traslazionale. Campioni di midollo osseo completi di alta-qualità, bassa-contaminazione e sono la premessa e il fondamento di dati sperimentali affidabili. La puntura del midollo osseo e la biopsia del midollo osseo sono le tecniche di campionamento del midollo osseo in vivo più diffuse per i primati non-umani. Diversamente dal normale prelievo di sangue venoso, questa tecnologia si basa su aghi professionali per biopsia cavi e rigidi per penetrare nell'osso corticale delle ossa lunghe e piatte e ottenere liquido midollare qualificato e tessuti centrali del midollo osseo intatti dalla cavità midollare. L'intera operazione dipende fortemente dalle specifiche prestazionali, dalla corrispondenza dei modelli e dall'applicazione standardizzata degli aghi per biopsia del midollo osseo. In combinazione con i protocolli di esperimenti su animali maturi e l'esperienza della letteratura, questo articolo elabora sistematicamente le specifiche operative complete- del processo di puntura e biopsia del midollo osseo NHP, concentrandosi sulle caratteristiche di selezione, sui vantaggi applicativi e sugli elementi essenziali del funzionamento standardizzato degli aghi per biopsia dedicati, per fornire una guida tecnica standardizzata per i ricercatori sperimentali.

Il principio tecnico di base della puntura e della biopsia del midollo osseo nei primati non-umani è coerente con il classico sistema di campionamento del midollo osseo canino (Crow et al., 2009). La logica fondamentale è quella di utilizzare aghi bioptici cavi rigidi per sfondare la dura barriera ossea corticale, localizzare con precisione la cavità midollare e ottenere campioni di fluido di midollo osseo e campioni di nucleo solido attraverso l'aspirazione a pressione negativa e l'inclusione con taglio rotante. Secondo le caratteristiche anatomiche degli NHP, i siti di campionamento comuni sono divisi in aree degli arti anteriori e posteriori. I siti di campionamento prioritari per gli arti posteriori includono la cresta iliaca e la fossa trocanterica femorale (Wolf & White, 2012), che sono adatti per la maggior parte dei modelli di primati di taglia media e grande-; il sito alternativo dell'arto anteriore è il grande tubercolo omerale, con posizione anatomica poco profonda e funzionamento conveniente, adatto per campioni supplementari ed esperimenti di campionamento ripetuti. Diversi siti di campionamento presentano differenze nello spessore osseo, nel diametro della cavità midollare e nella copertura dei tessuti molli, che devono essere abbinati alle specifiche corrispondenti degli aghi per biopsia del midollo osseo per garantire l'efficienza del campionamento e la qualità del campione.

Essendo un'operazione ossea invasiva, la puntura e la biopsia del midollo osseo dell'NHP causeranno una stimolazione definita dei tessuti e una risposta al dolore. Per garantire il benessere degli animali e un funzionamento sperimentale stabile, tutte le operazioni di campionamento devono essere eseguite in anestesia standardizzata. I ricercatori possono selezionare l'anestesia generale o l'anestesia locale mirata in base al ciclo sperimentale, alla frequenza di campionamento e allo stato individuale dell'animale, in modo da ottenere un'analgesia intraoperatoria e postoperatoria sufficiente. Inoltre, l'intero processo deve attenersi rigorosamente alle specifiche sperimentali sterili, tra cui la rasatura preoperatoria e la preparazione della pelle dell'area di campionamento, la disinfezione multi-standard con iodio povidone-e alcol, l'applicazione di asciugamani sterili e l'uso di guanti sterili e strumenti chirurgici, per evitare efficacemente infezioni locali, infiammazioni della ferita e altre complicazioni postoperatorie che influiscono sui successivi esperimenti ripetuti.

Classificazione, selezione e vantaggi prestazionali degli aghi speciali per biopsia del midollo osseo

L'ago per biopsia del midollo osseo è lo strumento di precisione principale del campionamento del midollo osseo NHP, che determina il tasso di successo di una puntura singola-, l'integrità del campione e il grado di contaminazione del sangue periferico. Al momento, esistono diversi modelli commerciali maturi di aghi speciali per il campionamento del midollo osseo per animali da esperimento, tra cui Rosenthal, Klima, ago sterno/iliaco dell'Illinois e ago Jamshidi. Ogni modello ha un design differenziato in termini di lunghezza dell'ago, diametro del calibro, struttura del nucleo interno e impugnatura, adattandosi a diversi tipi di corpo animale, caratteristiche anatomiche ossee e scopi di campionamento sperimentale.

Tra tutti i tipi di aghi, ilAgo per biopsia del midollo osseo Jamshidi 14Gè il gold standard per la biopsia del midollo osseo NHP, che è la specifica più raccomandata per le operazioni sperimentali. Questo tipo di ago per biopsia adotta una struttura cava rigida ottimizzata, con stiletto solido centrale abbinato. Il corpo dell'ago ha una durezza e tenacità moderate, che possono penetrare efficacemente nell'osso corticale dei primati senza piegarsi o scivolare. Il tagliente a spirale sulla punta dell'ago può incorporare e intercettare stabilmente i tessuti centrali del midollo osseo completi, evitando la frammentazione del campione e il danno da estrusione del tessuto causato da tipi di aghi non professionali. Rispetto agli aghi di aspirazione a calibro sottile-, l'ago per biopsia Jamshidi 14G ha un diametro della cavità interna maggiore, che può ottenere campioni di volume di-sufficiente garantendo al tempo stesso la sicurezza, soddisfacendo le esigenze di rilevamento morfologico, sezionamento dei tessuti e analisi dell'indice sperimentale della biopsia del nucleo. Rispetto agli aghi spessi sovradimensionati, può ridurre efficacemente il trauma osseo eccessivo e il sanguinamento intraoperatorio, bilanciando la qualità del campione e l'utilizzo ripetibile dell'animale.

Tutti gli aghi speciali per biopsia del midollo osseo sono progettati con uno stiletto centrale coordinato, che rappresenta una caratteristica strutturale chiave diversa dai normali aghi per iniezione. Lo stiletto può bloccare completamente la cavità cava del corpo dell'ago durante la puntura, impedire ai tessuti molli della pelle e ai detriti ossei di entrare nella cavità dell'ago per bloccare la tubazione e garantire il regolare avanzamento della successiva aspirazione a pressione negativa e del taglio del tessuto centrale. Negli esperimenti di campionamento ripetuti, i ricercatori devono selezionare le specifiche dell'ago in base al peso corporeo dell'animale e alle dimensioni delle ossa: aghi da biopsia corti e di calibro sottile-per piccoli primati (peso corporeo inferiore a 5 kg) e aghi Jamshidi convenzionali da 14G di media-lunghezza per individui di medie e grandi dimensioni, realizzando una corrispondenza precisa di attrezzature e oggetti sperimentali.

Principali precauzioni preoperatorie per il campionamento con ago da biopsia

Per evitare la coagulazione, l'emolisi e la contaminazione dei campioni e migliorare la percentuale qualificata di campioni sperimentali, prima del campionamento devono essere implementate specifiche operative e di pretrattamento standardizzate per gli aghi da biopsia. Primo,pretrattamento anticoagulante con eparina di aghi e siringheè obbligatorio. Prima dell'uso, estrarre una piccola quantità di soluzione di eparina per irrigare la parete interna dell'ago da biopsia e della siringa abbinata e scaricare completamente il liquido residuo, formando un rivestimento anticoagulante di eparina uniforme sulla parete interna della cavità dell'ago. Questa operazione può prevenire efficacemente la rapida coagulazione del fluido del midollo osseo dopo il campionamento, evitare il fallimento della preparazione dello striscio e del rilevamento delle cellule causato dalla coagulazione del campione ed è la fase di pretrattamento chiave per l'acquisizione del fluido del midollo osseo di alta-qualità.

In secondo luogo, per gli esperimenti su animali con campionamento ripetuto a lungo-termine,selezione rotazionale dei siti di punturadovrebbero essere adottate per evitare punture ripetute in un unico sito, che potrebbero portare a iperplasia dell'osso corticale, adesione locale dei tessuti e aumento della resistenza alla puntura, con conseguente fallimento del campionamento e aumento del trauma dell'animale. In termini di schema di analgesia, l'iniezione analgesica locale nella pelle e nei tessuti molli profondi del sito di puntura è superiore alla semplice anestesia generale, che può alleviare efficacemente il dolore e il disagio della ferita postoperatoria, ridurre la risposta allo stress dell'animale e facilitare il recupero postoperatorio e i successivi esperimenti ripetuti.

In termini di controllo del volume di campionamento, limitato dalla capacità della cavità dell'ago da biopsia e dal volume fisiologico del sangue degli animali da esperimento, il volume di campionamento di un singolo sito di puntura non deve superare i 2 ml. Un'estrazione eccessiva porterà a una grave diluizione del sangue periferico, ridurrà la proporzione di cellule nucleate e tessuti attivi del midollo osseo nel campione, interferirà con i risultati del rilevamento sperimentale e influenzerà l'accuratezza dell'analisi dell'indice ematologico e dell'osservazione morfologica dei tessuti.

Procedura operativa standard per la puntura della cresta iliaca (operazione con ago per biopsia del nucleo)

La cresta iliaca è il sito di campionamento più convenzionale e preferito per la biopsia del midollo osseo di primati non umani, con osso corticale spesso, ricco tessuto ematopoietico della cavità midollare e pochi organi importanti adiacenti, caratterizzato da elevata sicurezza e tasso di successo del campionamento. Dopo che l'animale è completamente anestetizzato, posizionarlo in posizione prona, piegare entrambi gli arti inferiori sotto l'addome per sollevare l'osso dell'anca ed esporre completamente l'area di campionamento della cresta iliaca. La maggior parte dei primati non-umani ha peli radi nella zona della cresta iliaca, che necessitano solo di una semplice rasatura e preparazione della pelle. La pelle viene disinfettata alternativamente con iodio povidone-e alcol e viene steso un asciugamano sterile per isolare l'area chirurgica e garantire l'operazione sterile.

Dopo aver confermato il confine della cresta iliaca mediante palpazione, praticare una piccola incisione cutanea con una lama chirurgica sterile sul lato anteriore della cresta iliaca per ridurre la resistenza all'attrito dell'ago da biopsia durante la penetrazione. Allineare l'ago per biopsia Jamshidi 14G con l'incisione, avanzare lentamente fino al bordo dorsale anteriore della cresta iliaca, mantenere il corpo dell'ago sempre perpendicolare al piano della cresta iliaca e applicare una pressione verso il basso continua e stabile ruotando il corpo dell'ago in senso orario. La postura di inserimento verticale dell'ago è la chiave per una biopsia di successo, che può garantire che la punta dell'ago entri accuratamente nella cavità midollare, evitare la penetrazione obliqua che porta alla spaccatura dell'osso corticale e al danno dei tessuti adiacenti e massimizzare le prestazioni di taglio e campionamento della punta dell'ago da biopsia.

Quando il corpo dell'ago penetra nell'osso corticale, l'operatore avvertirà ovviamente l'improvvisa riduzione della resistenza alla penetrazione e l'ago da biopsia potrà essere fissato stabilmente nel tessuto osseo senza tremare, indicando che la punta dell'ago è entrata con successo nella cavità midollare. A questo punto, estrarre completamente lo stiletto centrale, collegare una siringa sterile da 10 ml alla coda dell'ago da biopsia e applicare una pressione negativa stabile tirando il pistone. Il midollo osseo fresco dei primati è rosso scuro e schiumoso, con una viscosità maggiore rispetto al sangue periferico e contiene minuscolo tessuto osseo trabecolare di colore chiaro-, che è un campione di midollo osseo qualificato.

Se non viene estratto il liquido del midollo osseo, non estrarre il corpo dell'ago alla cieca. Ruotare l'ago da biopsia di 90 gradi –180 gradi per regolare l'intervallo di taglio e campionamento della punta dell'ago; se il problema persiste, reinserire lo stiletto, regolare leggermente la profondità del corpo dell'ago in avanti o all'indietro e applicare nuovamente una pressione negativa. Per i campioni sperimentali diagnostici, il volume di campionamento di un singolo sito è controllato entro 1 ml per garantire la purezza del campione; se per gli esperimenti è necessario un grande volume di campioni di midollo osseo, per il campionamento devono essere selezionati più siti di puntura anziché un'estrazione eccessiva in un unico sito. Dopo il campionamento, estrarre rapidamente l'ago da biopsia, applicare a lungo l'emostasi a compressione diretta sul sito della puntura e suturare la pelle con una sutura a filo singolo se si verifica un sanguinamento persistente.

Operazione di puntura e biopsia della fossa trocanterica femorale e dell'estremità prossimale dell'omero

La fossa trocanterica femorale è un sito di campionamento supplementare ideale per piccoli primati non-umani (peso corporeo<5kg). The local bone structure is shallow, and the medullary cavity is concentrated, which is convenient for the positioning and penetration of fine-gauge biopsy needles. However, the proximal thigh muscle layer of large primates is thick, resulting in large puncture resistance and difficult operation. The core operation principle is consistent with iliac crest biopsy: place the animal in lateral position, hold the proximal thigh with the palm, locate the trochanteric fossa at the inner and distal side of the femoral greater trochanter by thumb palpation, insert the biopsy needle toward the femoral shaft to penetrate into the medullary cavity, and complete negative pressure aspiration and specimen collection according to the standard needle operation procedure.

L'omero prossimale è un altro efficiente sito di campionamento alternativo. Il diametro dell'osso lungo omerale è maggiore e la cavità midollare è più ampia e meno profonda, rendendo il posizionamento dell'ago bioptico più accurato e l'operazione più semplice. Posizionare l'animale in posizione laterale, tenere l'arto anteriore prossimale, palpare il solco intertubercolare tra i tubercoli omerali maggiore e minore, inserire l'ago da biopsia verso l'asta omerale per entrare nella cavità midollare. Questo sito ha bassi requisiti di precisione del corpo dell'ago, un basso tasso di fallimento della perforazione ed è adatto per campioni rapidi ed esperimenti su animali in batch.

Applicazione approfondita del metodo di perfusione delle ossa lunghe e dell'ago per biopsia del nucleo.-

Diversamente dalla puntura convenzionale con ago singolo-, il metodo di perfusione delle ossa lunghe (Kushida et al., 2000) è una tecnologia di campionamento del midollo osseo di elevata-purezza adatta per esperimenti ad alta-precisione, che richiede l'uso cooperativo di due aghi per biopsia del midollo osseo. L'operazione richiede l'inserimento di aghi da biopsia abbinati nella cavità midollare rispettivamente su entrambe le estremità della diafisi dell'osso lungo, l'iniezione lenta di soluzione salina normale sterile attraverso un ago da biopsia e la raccolta del midollo osseo-contenente il perfusato in un contenitore sterile chiuso attraverso il tubo di prolunga collegato all'altro ago. Questa modalità di campionamento cooperativo a doppio{8}}ago evita efficacemente la contaminazione del sangue periferico nella puntura convenzionale e i campioni di midollo osseo ottenuti hanno una purezza più elevata, adatta per la separazione delle cellule staminali, la coltura in vitro e gli esperimenti di rilevamento omico ad alta{9}}precisione.

Operazione differenziata di aspirazione del midollo osseo e biopsia centrale basata su aghi per biopsia

L'aspirazione del midollo osseo e la biopsia del nucleo condividono lo stesso sito di campionamento e l'attrezzatura per l'ago da biopsia, ma la logica operativa dell'ago postoperatorio è completamente diversa, il che determina i due tipi di campioni sperimentali: fluido di midollo osseo liquido e tessuto centrale di midollo osseo solido. Inaspirazione del midollo osseo, dopo aver fissato l'ago da biopsia nella cavità midollare, estrarre lo stiletto e collegare una siringa per applicare una pressione negativa per estrarre il fluido liquido del midollo osseo, che viene utilizzato per il conteggio delle cellule, la morfologia dello striscio e il rilevamento della citometria a flusso.

Inbiopsia del midollo osseoconcentrandosi sui campioni di tessuto, dopo aver estratto lo stiletto, l'ago da biopsia Jamshidi viene fatto avanzare ulteriormente di 1–2 cm nella cavità midollare attraverso una pressione stabile e una rotazione lenta. Il tagliente a spirale sulla punta dell'ago può avvolgere completamente il tessuto centrale del midollo osseo. Quindi allentare il corpo dell'ago ruotandolo e oscillandolo, ritrarlo leggermente e reinserirlo per separare il fondo del tessuto centrale dalla trabecola ossea. Dopo aver confermato che il tessuto è completamente separato, estrarre integralmente l'ago da biopsia mediante trazione rotatoria. Infine, spingere il campione di nucleo di midollo osseo solido intatto fuori dalla cavità dell'ago con uno spintore lineare e fissarlo con formalina al 10% per la sezione tissutale e l'analisi patologica.

Conclusione

L'applicazione standardizzata degli aghi per biopsia del midollo osseo è la chiave principale del successo degli esperimenti di puntura e biopsia del midollo osseo di primati non-umani. L'ago per biopsia 14G Jamshidi, con il suo design strutturale ottimizzato e le prestazioni di campionamento stabili, è l'attrezzatura preferita per la biopsia del nucleo NHP. I ricercatori devono selezionare le specifiche dell'ago in base al tipo di corpo animale e agli scopi sperimentali, implementare rigorosamente il pretrattamento con eparina, i protocolli di funzionamento sterile e di rotazione del sito e padroneggiare le tecniche operative differenziate di aspirazione e biopsia centrale. La selezione e il funzionamento standardizzati degli aghi possono migliorare efficacemente la purezza e l'integrità dei campioni, ridurre i traumi degli animali e gli errori sperimentali e fornire un solido supporto tecnico per l'ematologia preclinica e la ricerca di medicina traslazionale basata su modelli di primati non- umani.